Sviluppo di linee iPS per studi farmacologici
Nell’ambito del progetto sono stati condotti esperimenti che hanno evidenziato che l’indicatore genetico del calcio cellulare GCaMP6, è visibile nei neuroni umani derivati da cellule iPS nel momento in cui sono stimolati e sviluppano attività elettrica. Il GCaMP6 permette quindi di visualizzare l’attività elettrica in queste colture neuronali e determinare il periodo in cui tale attività è massima. Volendo quindi integrare il GCaMP6 in modo stabile nel genoma di cellule iPS da utilizzare per screening farmacologici, abbiamo pianificato di integrare il reporter GCaMP6, tramite la tecnica del CRISPR/Cas9, in un sito genomico considerato “safe harbor”, in quanto mostrava di non essere legato a possibili alterazioni di espressione dei geni endogeni e al contempo permetteva alti livelli di espressione del gene integrato.
L’aggiunta del gene per la resistenza alla Neomicina ci permetterà di selezionare un clone cellulare puro con il reporter integrato in tutte le cellule.
Dopo avere lipoinfettato le cellule iPS, sono stati cresciuti i cloni che sono attualmente in fase di test per verificare la correttezza dell’integrazione genomica.
Sviluppo di linee per studi di elettrofisiologia
Per quanto riguarda lo studio di funzionalità neuronale con tecniche di elettrofisiologia extracellulare, microscopia confocale, fluorescenza e luminescenza, abbiamo cercato di ottimizzare le condizioni di differenziamento delle cellule umane nei neuroni, effettuando la prima fase di crescita e il differenziamento su piastra. Il protocollo è partito da cellule NPC umane da soggetto sano (cellule precursore neuronale differenziate da cellule di paziente fornite dal consorzio), poi seminate su piastre, in terreno di crescita.
Utilizzando diverse tipologie di terreni di crescita, alcuni arricchiti per indurre il differenziamento nel sottotipo neurale dopaminergico, dopo 4 settimane, è stata ottenuta una rete di neuroni differenziati, con un notevole vantaggio in termini di sviluppo della rete, rispetto ai test precedenti in cui tutte le fasi erano effettuate sui supporti MEA (multi-electrode array).
Nella Figura 1 sono mostrati neuroni umani differenziati da NPC piastrati sui supporti MEA. Nella Figura 2, i Neuroni umani sono stati colorati per marcatori dello stato di differenziamento.
L’analisi elettrofisiologica delle reti ottenute, ha rilevato una distribuzione omogena dei segnati di attività elettrica anche se con ampiezza inferiore rispetto a quella tipica delle colture primarie neuronali.
